Western blot

De eerste stap van een Western blot is de scheiding van het eiwitmengsel door middel van gelelektroforese. Het doel hiervan is om de complexe mix van eiwitten uiteen te splitsen in goed gedefinieerde bandjes, zodat ze later specifiek gedetecteerd kunnen worden.

De eiwitsamples worden hiervoor in een gel geladen, in kleine welletjes. Tijdens de elektroforese migreren de eiwitten door een dragermatrix – meestal polyacrylamide – onder invloed van een elektrisch veld. Polyacrylamide gedraagt zich als een moleculaire zeef, waarbij de poriegrootte kan worden aangepast door de concentratie acrylamide te variëren. Gels met een laag percentage worden gebruikt om grote eiwitten te scheiden, gels met een hoog percentage zijn geschikt voor kleinere eiwitten.

Er bestaan meerdere vormen van eiwit-elektroforese, zoals Native-PAGE en iso-elektrische focussering, maar in de context van Western blotting is SDS-PAGE veruit de meest gebruikte methode. Bij SDS-PAGE worden eiwitten vóór het laden gemengd met een buffer die het detergens SDS bevat. Deze zeepachtige stof denatureert de eiwitten en vouwt ze open tot lineaire polypeptiden. SDS maakt de eiwitketens daarnaast negatief geladen. Het gevolg is dat de migratie tijdens de elektroforese vrijwel uitsluitend wordt bepaald door het moleculair gewicht: kleinere polypeptiden bewegen sneller door de gel richting de positieve pool.

De gescheiden eiwitbanden worden vervolgens overgebracht van de gel naar een vast draagmembraan. Het membraan bestaat meestal uit nitrocellulose of PVDF; materialen met een hoge affiniteit voor eiwit. De overdracht van eiwitbandjes naar het membraan vindt plaats onder invloed van een elektrische stroom, en wordt 'blotting' of transfer genoemd. De reden dat men deze stap uitvoert, is omdat de eiwitbandjes in een membraan makkelijk toegankelijk zijn voor (detecterende) antilichamen. Een gel is hier te dik voor; de antilichamen kunnen niet door de gelmatrix heen.

Blotting gebeurt vaak in een aparte transfer-tank of in een gespecialiseerd systeem (semi-dry transfer). Het membraan – dat dezelfde lengte en breedte heeft als de gel – wordt over de gel heen gelegd, en beide zijden worden afdekt met filterpapier en een spons. Belangrijk hierbij is dat het membraan tussen de gel en de positief geladen anode ligt, dit is immers de richting waarin de eiwitbandjes zich zullen bewegen. Het stapeltje wordt in het overdrachtssysteem geplaatst en gedurende een bepaalde tijdsperiode aan elektrische stroom aangesloten. Na een uur zijn alle eiwitten van de gel in het membraan gedreven en gehecht.

Het eiwit waarin men geïnteresseerd is kan gedetecteerd worden met een voor dat eiwit specifiek antilichaam. In de moderne biochemie wordt het eiwit van interesse meestal gedetecteerd via een tweestapsdetectie met behulp van een primair en een secundair antilichaam. Het primaire antilichaam herkent een specifieke epitoop op het eiwit (dit kan een natuurlijk voorkomend deel van het eiwit zijn, of een toegevoegde eiwit-tag). Het primaire antilichaam bindt specifiek aan deze epitoop op de blot.

Na incubatie met het primaire antilichaam wordt de blot gewassen om niet-specifieke bindingen te verwijderen. Vervolgens wordt een secundair antilichaam toegevoegd dat specifiek gericht is tegen het primaire antilichaam. Dit secundaire antilichaam is meestal afkomstig van een andere diersoort (bijvoorbeeld geit-anti-muis als het primaire antilichaam uit muis komt), en bindt aan de constante regio van het primaire antilichaam.

Het secundaire antilichaam is gelabeld met een detecteerbare groep, zoals een enzym – bijvoorbeeld horseradish peroxidase (HRP) of alkalische fosfatase (AP) – of een fluorofoor. Wanneer een geschikt substraat wordt toegevoegd, produceert het enzym een kleurreactie (chemiluminescentie), of in het geval van een fluorofoor kan het eiwit direct worden gevisualiseerd met behulp van fluorescentieapparatuur. De blot wordt in een geschikt detectiesysteem ontwikkeld.