Thermocycler
Een thermocycler of PCR-machine is een programmeerbaar laboratoriumapparaat waarmee men DNA-fragmenten kan vermenigvuldigen via polymerasekettingreactie. Het apparaat is sinds zijn ontwikkeling in de jaren 1980,[1] uitgegroeid tot een zeer wijdverspreid instrument in moleculaire biologie.
Een thermocycler bestaat uit een verwarmingsblok (thermal block) met gaatjes waar PCR-buisjes of een PCR-plaat in passen. De reactiemengsels in de PCR-buisjes zijn meestal 20–50 microliter (µL). Boven het blok zit een verwarmd deksel die condensvorming voorkomt. Het apparaat voert snelle en nauwkeurige temperatuurswisselingen uit in herhaalde cycli, die nodig zijn voor de opeenvolgende stappen van de PCR-reactie (denaturatie, annealing en extensie).[2]
Via een software-interface op het apparaat kan de gebruiker een PCR-protocol instellen: de temperaturen, de tijdsduur per stap en het aantal herhalingen. Deze parameters moeten meestal voor specifieke primers of DNA-mixen geoptimaliseerd worden. De machine voert het programma automatisch uit, in een tijdspanne van enkele uren. Moderne thermocyclers hebben vaak ook opties zoals een gradiëntfunctie waarbij in één run verschillende annealingtemperaturen getest kunnen worden.
Real-time thermocycler
Een real-time PCR-thermocycler, ook wel qPCR-machine genoemd, is een gespecialiseerde thermocycler die niet alleen de temperatuurcycli van een gewone PCR uitvoert, maar tegelijkertijd de hoeveelheid DNA die tijdens de reactie ontstaat meet. Dit gebeurt door middel van fluorescentie: in de reactie worden stoffen toegevoegd die licht gaan uitzenden wanneer ze zich binden aan dubbelstrengs DNA.[3] De machine bevat naast het verwarmingsblok daarom ook een optisch systeem – met lampen/lasers en detectoren – dat per cyclus de fluorescentie detecteert. De bijbehorende software zet dit om in curves waarmee de hoeveelheid van het doelwit-DNA kan worden gekwantificeerd. Daardoor is een qPCR-machine essentieel voor toepassingen waarbij nauwkeurige kwantificatie van nucleïnezuren nodig is, zoals in de medische diagnostiek en genexpressieanalyse.[3]
Een klassieke qPCR-machine van Applied Biosciences met geopende lade
Amplificatiecurves die de hoeveelheid target-DNA van elke sample over de tijd weergeven
Zie ook
- ↑ (en) Weier HU, Gray JW. (1988). A programmable system to perform the polymerase chain reaction. DNA 7 (6): 441–7. PMID 3203600.
- ↑ (en) Khandpur RS (2019). Compendium of Biomedical Instrumentation. Wiley, "Thermocycler (PCR Machine)". ISBN 978-1-119-28812-1.
- 1 2 (en) Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Fenrich J. (2019). The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time. Trends in Biotechnology 37 (7): 761–774. DOI: 10.1016/j.tibtech.2018.12.002.