Kwantitatieve PCR

Amplificatiecurven van een qPCR. De grafiek toont de toename van fluorescentie (y-as) tijdens opeenvolgende PCR-cycli (x-as). Elke gekleurde lijn vertegenwoordigt een monster. De rode lijn markeert de drempelwaarde, het punt waarop de fluorescentie boven de achtergrond uitstijgt. Monsters met meer start-DNA bereiken deze drempel bij een lager aantal cycli.

Kwantitatieve PCR (qPCR), ook real-time PCR genoemd, is een techniek in de moleculaire biologie op basis van de polymerasekettingreactie.^[1] Deze techniek wordt toegepast om de hoeveelheid DNA of RNA in een onderzoeksmonster nauwkeurig te meten.

Kwantitatieve PCR maakt gebruik van chemische kleurstoffen (dyes) die fluoresceren wanneer ze aan dubbelstrengs DNA binden. In tegenstelling tot normale PCR, waarbij het resultaat pas na afloop van de reactie zichtbaar is via bijvoorbeeld gel-elektroforese, wordt bij qPCR de fluorescentie gedurende het hele reactieverloop gemeten (in real time). Het fluorescentiesignaal is evenredig aan de hoeveelheid gevormd DNA, waardoor onderzoekers de aanvangsconcentratie van het nucleïnezuur kunnen berekenen.

De methode wordt in wetenschappelijk onderzoek zeer algemeen gebruikt om genexpressie te analyseren. Hiervoor wordt vaak eerst mRNA uit een cel of weefsel geïsoleerd, en dit RNA wordt middels reverse-transcriptase omgezet in cDNA, dat vervolgens in de qPCR-machine kan worden gekwantificeerd. Deze variant wordt ook wel RT-qPCR genoemd.^[2] Kwantitatieve PCR heeft een hoge gevoeligheid en specificiteit, en wordt daarom ook routinematig toegepast bij de diagnostiek van infectieziekten.^[3]

Analysemethode

Een belangrijk kenmerk van kwantitatieve PCR is dat de hoeveelheid DNA in een monster gemeten wordt tijdens het reactieproces. Dit gebeurt aan de hand van de Ct-waarde (Cycle threshold), ook wel Cq-waarde genoemd. Tijdens de PCR neemt de fluorescentie toe naarmate meer DNA wordt gevormd. De qPCR-software stelt een drempelwaarde (threshold) in op een punt boven de achtergrondruis, waar de fluorescentie betrouwbaar meetbaar wordt. De Ct-waarde is het aantal PCR-cycli dat nodig is voordat de fluorescentie van het monster deze drempelwaarde overschrijdt.

Een lage Ct-waarde betekent dat het doel-DNA in hoge concentratie aanwezig was bij de aanvang van de reactie (veel kopieën). Een hoge Ct-waarde duidt op een lage aanvangsconcentratie. Omdat de amplificatie exponentieel verloopt, komt een verschil van één Ct overeen met een verdubbeling van de hoeveelheid DNA.^[1]

Zie ook

Polymerasekettingreactie

Bronnen, noten en/of referenties

1 2 (en) Fraga D, Meulia T, Fenster S. (2014). Real‐Time PCR. Current Protocols Essential Laboratory Techniques 8 (1). DOI: 10.1002/9780470089941.et1003s08.
↑ (en) Adams G. (23 juni 2020). A beginner’s guide to RT-PCR, qPCR and RT-qPCR. The Biochemist 42 (3): 48–53. DOI: 10.1042/BIO20200034. Geraadpleegd op 20 oktober 2025.
↑ (en) Logan J, Edwards K, Saunders N. (2009). Real-Time PCR: Current Technology and Applications. Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-39-4.

[fraga-1] 1 2 (en) Fraga D, Meulia T, Fenster S. (2014). Real‐Time PCR. Current Protocols Essential Laboratory Techniques 8 (1). DOI: 10.1002/9780470089941.et1003s08.

[adams-2] (en) Adams G. (23 juni 2020). A beginner’s guide to RT-PCR, qPCR and RT-qPCR. The Biochemist 42 (3): 48–53. DOI: 10.1042/BIO20200034. Geraadpleegd op 20 oktober 2025.

[logan-3] (en) Logan J, Edwards K, Saunders N. (2009). Real-Time PCR: Current Technology and Applications. Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-39-4.

[1]

[2]

[3]