Confocale microscopie
Confocale microscopie, of confocale laserscanmicroscopie (Engels: confocal laser scanning microscopy - CLSM) is een optische beeldvormingstechniek voor het verhogen van de optische resolutie en het contrast van een microfoto door middel van een ruimtelijk gaatje om onscherp licht bij beeldvorming te blokkeren. Door meerdere tweedimensionale beelden op verschillende diepten in een monster vast te leggen, kunnen driedimensionale structuren (een proces dat bekend staat als optische doorsnede) binnen een object worden gereconstrueerd. Deze techniek wordt op grote schaal gebruikt in wetenschappelijke en industriële context en typische toepassingen zijn in de biowetenschappen, halfgeleiderinspectie en materiaalkunde. Het principe van de confocale laserscanmicroscopie is begin jaren 50 ontwikkeld en in 1957 gepatenteerd door de Amerikaanse wetenschapper Marvin Minsky. Evenwel pas nadat halverwege de jaren 1980 laserlicht gebruikt werd, heeft confocale fluorescentiemicroscopie een grote vlucht genomen.
Licht reist door het monster onder een conventionele microscoop zo ver in het monster als het kan doordringen, terwijl een confocale microscoop slechts een kleinere lichtstraal op één smal diepteniveau tegelijk focust. De CLSM bereikt een gecontroleerde en zeer beperkte scherptediepte.
Confocale microscopen worden niet zozeer gebruikt voor gewoon licht maar eerder voor het nemen van fluorescente foto's, de techniek van fluorescentiemicroscopie. Hiervoor moeten de stalen, onder andere cellen en weefsels eerst fluorescent worden gelabeld. Hiervoor wordt meestal gebruikgemaakt van antistoffen tegen een molecuul waarin men is geïnteresseerd, zoals een eiwit of DNA. Daarna kan men met behulp van een monochromatische lichtbron, voorbeelden Hg-lamp en laser, een fluorescente foto maken.
Varianten en verbeteringen
Verbetering van de axiale resolutie
De puntspreidingsfunctie van het gaatje is een ellipsoïde, meerdere keren zo lang als breed. Dit beperkt de axiale resolutie van de microscoop. Een techniek om dit te overwinnen is 4Pi-microscopie, waarbij invallend en/of uitgezonden licht zowel van boven als onder het monster kan interfereren om het volume van de ellipsoïde te verminderen. Een alternatieve techniek is confocale theta-microscopie. Bij deze techniek staan de kegel van verlichtend licht en het gedetecteerde licht schuin ten opzichte van elkaar (beste resultaten als ze loodrecht staan). De kruising van de twee puntspreidingsfuncties geeft een veel kleiner effectief monstervolume. Hieruit evolueerde de enkelvlaks verlichtingsmicroscoop. Bovendien kan deconvolutie worden gebruikt met behulp van een experimenteel afgeleide puntspreidingsfunctie om het onscherpe licht te verwijderen, waardoor het contrast in zowel het axiale als het laterale vlak wordt verbeterd.
Super resolutie
Er zijn confocale varianten die een resolutie bereiken die onder de diffractielimiet ligt, zoals gestimuleerde emissiedepletiemicroscopie (STED). Naast deze techniek is er een breed scala aan andere (niet confocale gebaseerde) superresolutietechnieken beschikbaar, zoals Photoactivated localization microscopy (PALM), (d)STORM, SIM, enzovoort. Ze hebben allemaal hun eigen voordelen, zoals gebruiksgemak, resolutie en de behoefte aan speciale apparatuur, buffers of fluoroforen.
Werking bij lage temperatuur
Om monsters bij lage temperaturen in beeld te brengen, zijn twee hoofdbenaderingen gebruikt, beide gebaseerd op de confocale microscopiearchitectuur met laserscanning. Een benadering is het gebruik van een cryostaat met continue stroom: alleen het monster heeft een lage temperatuur en wordt optisch behandeld via een transparant venster. Een andere mogelijke benadering is om een deel van de optiek (vooral het microscoopobjectief) in een cryogeen dewarvat te plaatsen. Deze tweede benadering, hoewel omslachtiger, garandeert een betere mechanische stabiliteit en vermijdt de verliezen als gevolg van het raam.
Moleculaire interactie
Om moleculaire interacties te bestuderen met behulp van de CLSM, kan Förster resonance energy transfer (FRET) worden gebruikt om te bevestigen dat twee eiwitten zich binnen een bepaalde afstand van elkaar bevinden.
Bronnen
- Dit artikel of een eerdere versie ervan is een (gedeeltelijke) vertaling van het artikel Confocal microscopy op de Engelstalige Wikipedia, dat onder de licentie Creative Commons Naamsvermelding/Gelijk delen valt. Zie de bewerkingsgeschiedenis aldaar.
Externe links
- Optical Sectioning & Confocal Microscopy een seminar van biochemicus en -fysicus Kurt Thorn, iBiology.org
